血凝知识

凝血筛选实验

血管、血小板、凝血因子及血液流变等因素通过本身促凝或抗凝作用,组成了血液内复杂、功能对立的凝血系统和抗凝系统。这两个系统通过机体的生理调节保持着动态平衡,使得生理状态下血液在血管中不断的流动循环,既不溢出于血管之外(出血),又不凝固于血管中(血栓)。止血与血栓实验的目的就是通过各种因子的检测从不同侧面、不同环节了解发病原因、病理过程,进而进行疾病的诊断和治疗。

 

现代凝血理论将人体止血功能分为三个时期:

一期止血:血管壁、血小板和粘附蛋白的相互作用→血小板凝块,常用试验包括:

● 出血时间(BT)
● 血小板计数
● 血小板聚集试验等

凝血(二期止血):凝血因子和抗凝系统共同作用→巩固血小板凝块→不溶性纤维蛋白网,常用试验包括:

● 凝血酶原时间 (PT)
● 活化部分凝血活酶时间(APTT)
● 纤维蛋白原(Fib)
● 凝血酶时间(TT)

纤溶调节:纤溶系统和抑制物共同作用→凝块消散,常用试验包括:

● 纤维蛋白原降解产物(FDP)
● D-二聚体(DDI)
● 纤溶酶原

二期止血过程如图1所示

Contact system:接触系统;Cellular injury:细胞损伤;TF:组织因子;Fibrinogen:纤维蛋白原
Fibrin monomer:纤维蛋白单体;Crosslinked fibrin:交联纤维蛋白HMWK:高分子量激肽原;PK:激肽释放酶原
Antithrombin:抗凝血酶;Activated Protein C: 活化蛋白C;Protein S:蛋白S;TFPI:组织因子途径抑制物

图1 凝血途径

动脉或静脉内血液凝固的启动大多由组织因子而不是Ⅻ因子所触发。大多数非血管内皮细胞都能表达组织因子(Tissue Factor, TF),动脉或静脉壁的损伤使组织因子暴露于血液中从而促发血栓形成。TF将因子Ⅶ(FⅦ)激活成FⅦa,FⅦa一旦与组织因子结合,即激活因子Ⅸ(FⅨ)和因子Ⅹ(FⅩ),分别生成活化的因子Ⅸ(FⅨa)和活化的因子Ⅹ(FⅩa)。FⅩ的活化比FⅨ的活化更有效率。FⅩa 将少量的凝血酶原转变为凝血酶。这一低浓度的凝血酶足以激活血小板以及凝血中关键的辅因子, 即因子Ⅴ(FⅤ)和因子Ⅷ(FⅧ)。这些凝血酶介导的步骤是凝血过程放大所必需的。

凝血过程的放大受FⅨa和FⅩa的影响。在钙的参与下,FⅨa与FⅧa结合在激活的血小板表面,形成活化因子Ⅹ的复合物。然后FⅩa在激活的血小板表面与FⅤa结合,这也是一个钙依赖的过程,形成凝血酶原酶复合物。该复合物激活凝血酶原,而生成的凝血酶则与血小板表面分离,将纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体。纤维蛋白单体聚合形成纤维蛋白网,纤维蛋白网由活化的因子XIII(FXIIIa)所加固并发生交联。

凝血酶通过如上所述的机制反馈激活FⅤ和FⅧ, 并通过激活与血小板结合的FⅪ,导致FⅩa 的进一步形成,从而形成更多的凝血酶,激活纤维蛋白原生成纤维蛋白并最终形成血栓。

为了简化易于应用,更多使用如图2的简化版,凝血分为三个途径:外源性途径、内源性途径、共同途径。

图2 凝血途径简化版

根据该途径,常规使用以下四个实验可以凝血功能进行有效筛查

● 凝血酶原时间 (PT)
● 活化部分凝血活酶时间(APTT)
● 纤维蛋白原(Fib/Fbg)
● 凝血酶时间(TT)

 

凝血酶原时间-PT

■ 测试原理

PT试剂包括组织因子(TF),磷脂和钙离子。组织因子与FVII结合后激活外源途径。磷脂作为辅因子参与凝固反应。

磷脂和组织因子结合物被称为促凝血酶原激酶。同时钙离子也是凝固反应所必需的:它的作用是促使因子与磷脂相结合。假如钙离子被加入到试剂中(PT试剂普遍如此),这种试剂便被称为钙化促凝血酶原激酶。

因为在此试剂无须接触激活阶段,凝固过程仅仅依赖于外源途径因子(FVII)和共同途径因子:FX、FV、凝血酶原(FII)和纤维蛋白原(FI)。

■ 促凝血酶原激酶的来源

​◆ 原料
- 兔脑粉提取
- 人胎盘组织提取
- 重组组织因子(rTF)+人工合成的纯化磷脂

◆ 磷脂
- 从兔脑粉和人胎盘组织:生理组成
- 人工合成或纯化:可能导致试剂的不同反应

◆ 组织因子
- 从兔脑粉和人胎盘组织中提取:完全的真核生物三元结构(生物体包含核膜)
- 重组TF由大肠杆菌产生(原核生物,无核膜),一种不同的糖 可能导致与真核生物不同的三元结构。而且,因为重组TF是从大肠杆菌中提取,所以rTF必须纯化。
因此重组促凝血酶原激酶与传统方法不同。这样可以解释反应的不同之处:重组促凝血酶原激酶对肝病的敏感性很低,同时对FVII极度敏感。

■ PT的临床应用

  • 术前的筛查试验
    ◆ 结果报告:活动度(%)或秒
  • 凝血因子缺乏的过筛试验(FI,FII,FV,FVII,FX)
    ◆ 先天性缺乏
    ◆ 获得性缺乏
    • 新生儿的出血性疾病
    • 肠吸收失调
    • 肝脏疾病 (硬化,肝炎,黄疸)
    • 弥散性血管内凝血(DIC)
  • 口服抗凝药物的监测
    ◆ 国际标准化比率-INR

 

口服抗凝剂治疗(OAT)

  • 口服抗凝剂降低凝血因子II,VII,IX,X 水平,同样降低PC和PS水平
  • 生物学作用:
    ◆ 生物药效率接近100%
    ◆ 延迟效应:
    • 开始治疗至少5天才能达到完全效应
    • 停止治疗至少10天才能完全清除
  • 常规治疗但是 …
    ◆ OAT 与出血风险增加有关
    • 法国每年在500 000 患者中 有17 000 患者用OAT
    • 24个月内出血发生率为:10.6 %

◆ 口服抗凝剂水平太低与血栓增加风险有关

  • 监测的目的是保持患者处在严密的治疗范围内
    ​◆ 对于口服抗凝治疗的个体反应差异较大并不可预知
    • OAT 个体易感性取决于:
      -遗传性因素
      -获得性因素
  • 治疗范围非常严密

OAT 对凝血因子的影响

  • 国际上不同的代表组织推荐INR的治疗范围
    ◆ 最常见的来自于ACCP1,BSCH2 或GEHT3
    ◆ 所推荐的值为INR治疗范围值或“INR靶值”

 

INR(国际标准化比率)

1977年,世界卫生组织(WHO)规定了一批人脑促凝血酶原激酶作为一级国际参考试剂(IRP)。随后,几种二级标准品产生了。

在任何PT试剂所测标本的PR对数值和IRP所测标本的对数值呈线形相关的基础上,一种定标系统得以发展。INR值代表着包含了IRP的PT比值(取代了PT测试试剂)表达PT结果。

■ INR的目的

  • 提高对患者的管理
    ◆ 国际推荐的对OAT治疗范围的管理
    ◆ 增加患者的安全性
  • 提高室间可比性
    ◆ 提高实验室的质量

■ INR值的计算

INR是值指每个患者的PT比值的ISI次方。PT比值是指将患者的PT值除以平均正常PT值(MNPT)。MNPT是指至少20个健康人新鲜血浆的平均PT测试值。每一批PT试剂都必须标定ISI值。

INR = [PT / MNPT] ISI

■ ISI(国际敏感指数)

厂家将每一批新的促凝血酶原激酶与二级国际参考试剂共同测试正常人和患者的新鲜血浆,并通过定标,确定其国际敏感指数(ISI)。

  • 采集20个健康人和60个OAT患者新鲜标本
  • 采用国际参考PT试剂和厂家新批号试剂样本(兔脑促凝血酶原激酶)进行定标
    ◆ PT(秒)绘制在log / log图上
    ◆ 手工参考方法
    ◆ 回归直线的斜率=ISI
  • ISI值适用于一种仪器
    当检测凝固的系统是可重复的,例如STA系列,对于任何ISI值已测定的仪器,所定的ISI值都是“真实”的,一致的。
  • 不同仪器的ISI值
    ISI值是通过计算记录的凝固时间得来的,而这些凝固时间是从凝固测试中得来。这就是为什么ISI值的改变不仅依赖于检测系统,而且随不同类型的仪器而改变(例如MLA和ACL都是光学检测,但是同一试剂的ISI值计算结果将不同)。
    甚至同一类型的仪器如果检测系统未真正标准化,同一批试剂的ISI值对于不同仪器是不同的。
    唯一的一条获得当地可靠的ISI值的途径是使用定标和质控来滴定ISI值。

■ MNPT的确定

    每个实验室需确定自己的MNPT

  • MNPT=5天内采集至少20个正常人新鲜血浆标本测量的PT几何平均值
    ◆ MNPT的及时校准是获得准确INR值的重要基础
    ◆ 质控血浆或正常混合血浆不能使用

■ INR的监测

  • 长期治疗,需要监测确保PT仍在治疗范围内
  • 注意事项:当出现下列情况时,更频繁的检测是必须的:
    ◆ 不稳定生物学结果,剂量变化,治疗过程变化,出项其它病理情况

■ PT延长的主要原因

 

活化部分凝血活酶时间-APTT

■ 测试原理

APTT试剂是血小板底物(磷脂)和一种激活物(绝大部分是硅土、白陶土、鞣花酸)的混合物。激活物激活接触阶段(FⅫ、FⅪ),启动凝血过程。磷脂作为辅因子参与凝固反应。钙离子也是凝固反应所必需的,它的作用是促使因子与磷脂相结合。于是,加入Cacl2启动凝固过程。

因为试剂中没有激活外源途径的成分,凝血过程依赖于内源途径因子(FⅫ、FⅪ、FⅨ、FⅧ),以及共同途径因子:FⅩ、FⅤ、凝血酶原(FⅡ)和纤维蛋白原(FⅠ)。

APTT途径的激活由接触阶段激活开始(FⅫ、FⅪ)。因此,APTT是两步分析,血浆与试剂必须共同孵育以激活接触阶段。为了获得因子的最佳活性,任何凝固测试都必须在体温下执行,所以第一次孵育仅需将血浆样品加热至37℃。

在为了接触阶段激活而进行第二次孵育之后,加入Cacl2启动凝固过程。

■ 试剂组成

  • 激活物
    ◆ 硅土,白陶土,鞣花酸,多元酚…
  • 磷脂
    ◆ 不同来源 : 动物,植物,人工合成…
  • 钙离子 ( 触发凝血)

■ APTT的临床应用

  • 手术前的筛选试验
  • 凝血因子缺乏的筛选
    ◆ 先天性缺乏
    • 如PT正常,FVIII,FIX,FXI或FXII也许缺乏
    • 如FVIII < 35%,APTT会表现异常
    • 血管性血友病(低FVIII)

◆ 获得性缺乏

  • 肝病,DIC,...
  • 肝素抗凝治疗监测

◆ 仅用于普通肝素

  • 狼疮抗凝物(LA)检测

■ 普通肝素治疗的监测

普通肝素(UFH)由不同分子量的多糖链组成。1/3的多糖链上具有能与抗凝血酶紧密结合的五糖结构。分子量:2,000到40,000道尔顿(平均15,000 D) ,肝素适用于血栓

的预防和治疗。

  • 缺点

◆ 半衰期短,剂量依赖性
◆ 非特异性结合
◆ 剂量反应难以预测
◆ 主要的副作用是出血

  • APTT监测试验

◆ 适用于肝素监测,但对不仅仅是肝素引起的凝血异常同样敏感,如:肝素、OAT重叠治疗或溶栓治疗。
◆ 对小剂量的预防用肝素不敏感。
◆ 大剂量肝素可能引起低于治疗量的APTT表现
◆ 引起APTT延长的其他情况:

  • 凝血因子的缺乏或存在抑制物
  • 狼疮抗凝物的存在

 

■ APTT延长的主要原因

■ LA的监测

常规APTT测试对于检测LA并不非常敏感。在这种情况下,想要获得较明显的APTT异常延长就需要一种辅助诊断途径。如果为了进一步明确诊断,需更敏感和特异的测试。

 

纤维蛋白原-Fib

■ 测试原理

采用Clauss凝固法定量检测纤维蛋白原含量。将凝血酶加到血浆中,使纤维蛋白原变成纤维蛋白,血浆便出现凝固。在有足量的凝血酶时,与不同含量的纤维蛋白原作用,其出现血浆凝固的时间与纤维蛋白原含量呈负相关。

■ 试剂组成

不同含量的人或牛凝血酶,浓度为足量,浓度从10到200 NIH/ml不等,通常在100NIH/ml左右

■ FIB的临床应用

  • Fib正常范围(成人):2 - 4 g/l(200 - 400 mg/dl)

◆ 手术前的筛选试验

◆ 诊断

  • 质量缺陷(异常纤维蛋白原血症)
  • 数量缺陷(先天性或获得性)

◆ Fib水平升高

  • 炎性综合征,糖尿病,肥胖,血栓性相关性疾病

 

凝血酶时间-TT

■ 测试原理

在预定量凝血酶作用下,正常血浆会在有限的和稳定的时间内发生凝固。将凝血酶加到血浆中,使纤维蛋白原变成纤维蛋白,血浆便出现凝固。

  • TT是一评估纤维蛋白形成过程的检测项目
  • TT同样也是一个用于补充PT和APTT的筛选实验

■ 试剂组成

不同含量的人或牛凝血酶, 浓度为预定量, 通常在1.5NIH/ml左右

■ TT的临床应用

  • TT延长表示(和/或)

◆ Fib异常

  • 质量(异常纤维蛋白原血症)
  • 数量:
    -先天性低或无纤维蛋白原血症
    -获得性低纤维蛋白原血症(肝病,DIC)

◆ 存在肝素、水蛭素
◆ 存在FDP

 

筛选实验异常结果的说明

 

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