血凝知识

D-二聚体

D- 二聚体是交联纤维蛋白在纤溶酶作用下产生的一种特异性降解产物,在正常人体血浆中含量很低,其增高表明体内有纤维蛋白血栓形成和纤溶发生。近年来,D-二体聚作为一种理想的纤维蛋白标记物受到越来越多的重视。

D-二聚体的形成

D-二聚体是交联纤维蛋白特异的降解产物,它的形成需要三个重要的步骤。

第一步,凝血系统的激活,大量的凝血酶原被活化形成有活性的凝血酶。在凝血酶作用下,纤维蛋白原先从α链上裂解出纤维蛋白肽A(FPA),生成纤维蛋白单体I;从β链上裂解出纤维蛋白肽B(FPB),生成纤维蛋白单体II。纤维蛋白单体I和纤维蛋白单体Ⅱ可以自行聚合成不稳定的交联纤维蛋白。

第二步,凝血酶在活化纤维蛋白原的同时也活化了XIII因子。活化的XⅢ因子使非交联的纤维蛋白在D区形成共价键,并形成稳定的交联纤维蛋白。

第三步,纤维蛋白的生成激活纤维蛋白溶解系统(f ibr inolysissystem,简称纤溶系统),纤溶系统是人体最重要的抗凝系统,由4种主要部分组成:纤溶酶原(plasminogen)、纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,如t-PA, u-PA)、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)。当纤维蛋白凝结块(fibrinclot)形成后,在tPA的作用下,纤溶酶原被活化成为纤溶酶,纤维蛋白溶解过程开始。纤溶酶降解纤维蛋白凝块形成各种可溶片段。这些可溶片段被称之为纤维蛋白(原)降解产物(FDP),其中就包括D-二聚体。

 

D-二聚体的实验室检测

D-二聚体,作为继发性纤溶的标志性产物,对于诊断血栓相关疾病(如:DIC:弥漫性血管内凝血、DVT:深静脉血栓和PE:肺栓塞等)、原发性或继发性纤溶系统疾病(肿瘤、妊娠高凝状态)以及进行溶栓治疗监测有着重要的意义。当体内发生血栓时,纤溶酶被激活,大量稳定的交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下分解并释放出D-二聚体,导致血浆D-二聚体浓度升高。大量研究表明,在适当的临界值(Cut-off 值)下,血浆D-二聚体浓度对于DVT和PE具有可靠的阴性预测值。因此该项测定常用于排除DVT与PE的诊断。此外D-二聚体对于DIC的诊断和溶栓治疗的监测也具有重要意义。

目前,对D-二聚体的检测实质上是对包含混合有D-二聚体的纤维蛋白降解片段进行测定。大约有超过30种检测方法和超过20种单克隆抗体被使用,使得D-二聚体在临床实验室获得广泛应用的同时,也面临着分析方法之间尚未实现标准化这一重要问题。定量分析结果在不同的分析方法中差异很大的原因,是由患者血浆中的D-二聚体的异源性很高并且单克隆抗体的特异性差异大所导致的。

■ D-二聚体检测方法介绍

◆ 乳胶凝集法 1983年Rylat t等将分离纯化的D-二聚体作为抗原,按常规方法筛选,最后获得一株DD-386/22抗D-二聚体的单克隆抗体。1986年Elms将此单克隆抗体共价吸附在乳胶颗粒上,用于定性或根据其稀释度半定量测定标本中的D-二聚体的含量。该测定方法在与ELISA方法的比较中相关性显著,并具有快速、特异、操作简单等特点,同时不需其他特殊设备,特别适用于急诊测定。但是由于方法学的原因不能得到定量检测的结果,限制了其在临床的广泛应用。

◆ 免疫比浊法 全自动血凝仪上普遍采用的定量检测D-二聚体的方法,5-7分钟即可得出结果。原理是用光度计检测微乳胶颗粒混悬液的吸光度变化。反应时用一束单色光射入通过共价键结合了特殊抗体的微乳胶颗粒混悬液,当混悬液中不存在要检测的抗原时,入射光的波长将远大于乳胶颗粒直径,此时入射光仅会被微量吸收;若混悬液中存在要检测的抗原时,由于被抗体包裹的微乳胶颗粒发生抗原-抗体结合反应,使微乳胶颗粒凝集形成大于入射光波长凝集物,此时入射光的吸收量增加,凭借这个额外增加的吸光度即可以检测出混悬液中的抗原水平。该方法具有操作简便速度快的优点。在2007年美国病理学会(CAP)组织的室间质评中,所有参加D-二聚体项目的实验室中,78.5%的实验室使用此方法进行D-二聚体的定量检测。但由于不同生产厂家选用的单克隆抗体种类和数量的差异,试剂检测性能也存在较大差异。

◆ 酶联免疫吸附法(ELISA) 1983年Rylatt和Elms建立了双抗夹心的ELISA法检测血浆中的D-二聚体。其包被抗体和酶标抗体均采用分离纯化后筛选出来的McAb(DD386/22)。该McAb能特异性地结合D-二聚体中的r'-r'连结键。通常情况下,常规ELISA的检测结果被认为是D-二聚体浓度的参考标准,但由于ELISA检测对实验室要求较高,检测时间需要约8小时,这使得实验室不能在标本送检当天得到结果,故在诊断单个患者的静脉血栓时并不实用,因此限制了其在大多数临床实验室的应用。

基于酶联免疫法的荧光抗体检测法(VIDAS D-二聚体) VIDAS D-二聚体用VIDAS免疫分析仪进行D-二聚体的检测。此方法在酶联免疫法基础上与荧光检测相结合,利用现成的单剂量试剂和分析仪中储存的校准系统,对单份样本进行检测。现成试剂由包被了鼠抗D-二聚体单抗的固相移液装置和试剂条组成,后者包含了检测D-二聚体的其他所需试剂:结合剂(碱性磷酸酶标记的鼠抗D-二聚体单抗)、洗涤剂、样品稀释剂和底物。将200ul血浆吸入试剂条后,所有步骤由分析仪完成。VIDAS D-二聚体敏感性很高,与经典ELISA法有很好的一致性。但其检测时间稍长,除常规离心15分钟外,样本检测时间需要35分钟并且不能和其他凝血检测项目同时得到结果。

◆ 免疫金标法 Gogstad用胶体金标记D-二聚体的单克隆抗体,建立了免疫过滤金标染色测定法。此法将单克隆抗体吸附在多孔薄膜并粘放在有多层吸收垫的塑料盘上,被检标本加入后即与该抗体相结合,然后加入胶体金标记的抗体,在薄膜上产生红色斑点。通过肉眼观察或用折射仪读数,与提供的标准色价或者测定标准品的折射读数相比对,可计算出标本中D-二聚体的含量。该法具有操作简单、快速,适用于急诊测定的优点。但是该方法仅可以通过手工单个检测,不适用于大标本量的实验室,并且有研究表明,由于阴性预测值有限,并不是非常适合于DVT和PE患者的筛查。

■ D-二聚体单位

◆ D-Dimer单位(D.D.U.)

  • 基于单个D-Dimer分子量的单位

◆ 纤维蛋白原当量单位(F.E.U.)

  • 基于形成D-Dimer的初始纤维蛋白原含量的单位

◆ Cut-off值:0.5 μg/ml F.E.U. 或 0.25μg/mL D.D.U

  • 0.5 μg/ml = 500 ng/ml

■ D-二聚体检测方法评价

由于方法学上的原因,选用不同方法测定同一份血浆或全血中的D-二聚体浓度往往不具有可比性。D-二聚体测定受到抗体特异性不同、纤维蛋白降解片段长短不一、针对不同片段制备的单克隆抗体不同以及抗体对同一份血浆中不同片段的结合能力差异的影响。比浊法测定还受到乳胶颗粒特征的影响,颗粒体积上的差异导致了在乳胶颗粒聚集时吸光特性也不一样,因此不同D-二聚体试剂的差异是不可避免的。

鉴于D-二聚体测定的方法学差异,在应用上很难实现标准化,也不易制备通用型的标准品或校准物。然而根据每个体系的检测特性,各自建立具有临床应用价值的Cut-off值,是一种可行的方法。该值可以在大规模临床试验的基础上获得,通过检出特征,选择适当的灵敏度和特异性来确定。由于D-二聚体的价值首先体现在过筛实验上,因此如果制定较低的Cut-off值就会使灵敏度过高而导致假阳性患者增多,而过高的假阳性率就

使得该项目失去了检测的特异性,达不到筛查的效果。而Cut-off值制定过高,则会导致假阴性增多,漏诊了深静脉血栓或肺栓塞,后果将不堪设想。Cut-off值的制定不应简单照搬厂家推荐值,应该参考在权威杂志发表的有临床诊断价值的实验结果,并在使用之初针对本地人群加以验证。

FACT(Fibrin Assay Comparison Trial有关纤维蛋白检测的国际专职评估和研究机构)发表的文章提出:“Although D-dimer has gained widespread clinical use as a parameter for detection of in vivo fibrin formation, the standardization issue has not been resolved and reference preparations and/or guidelines have not been distributed.”(虽然D-二聚体作为纤维蛋白形成的一项指标,在临床巳广泛使用,但其标准化问题至今未解决,也无标准品,甚至有关参照品制备的指导性文件也没有公布过。摘自Thromb Haemost 2001;85:671-8) 因此,评估D-二聚体试剂的优劣,需要通过充分的临床验证,通过观察阴性结果排除试验和阳性结果的确证实验的准确性,以及鉴别排除假阳性结果的临床符合性来进行综合考量。

■ Emo D-Dimer试剂特点

  • 免疫比浊方法,全自动定量检测D-二聚体浓度
  • 单克隆抗体包备的乳胶颗粒,具有理想的灵敏度
  • 宽线性范围0.097-10ug/ml(FEU),无需重稀
  • 自动稀释后线性可扩展至40ug/ml,
  • 小包装,高稳定性(2-8度开瓶后稳定14天),适合小标本量试验室
  • 7分钟得出结果,方便急诊
  • 自带定标品和稀释液,节省成本

D-二聚体测定的临床意义

■ 静脉栓塞(VTE)的排除

静脉血栓栓塞主要包括深静脉血栓症(DVT)以及它的主要并发症-肺栓塞(PE)。目前只有少数国家报导了DVT和PE发病率,在西方国家每年DVT和PE在一般人群中发病率分别约为0.1%和0.05%,但可能遗漏部分非致命性而没有记录的病例。美国现有数据显示每年DVT的发病率为80/100,000,在美国,每20人中将近有1人在一生中发生过DVT,而医院每年会收治将近600,000 DVT病人。DVT的致死性往往归结于大面积的PE,在美国每年会有200,000人死于DVT/PE。

◆ 深静脉血栓及肺栓塞单独凭临床症状不能完全确诊,必须依赖静脉造影术、肺部血管造影、超声波检查 (CUS)、闪烁扫描法(灌注,流动)等辅助检查。由于这些辅助检查具有创伤,而且敏感性和特异性不高,因此到目前为止没有一种检查能做到100%特异和100%敏感的。

◆ 深静脉血栓及肺栓塞单独凭临床症状不能完全确诊,必须依赖静脉造影术、肺部血管造影、超声波检查 (CUS)、闪烁扫描法(灌注,流动)等辅助检查。由于这些辅助检查具有创伤,而且敏感性和特异性不高,因此到目前为止没有一种检查能做到100%特异和100%敏感的。

◆ “金标准”,静脉造影

  • 侵入性检查,存在风险
  • 需要特殊设备和经过严格训练的操作人员
  • 成本高

因此临床需要有一种安全、有效的筛查试验来辅助诊断静脉血栓栓塞症,许多文献指出,血浆D-二聚体含量检测是VTE筛查的有效手段。

◆ 几乎所有急性疾病的病人(包括DVT或PE及其他急性疾病)D-Dimer浓度都会升高

  • D-Dimer升高对VTE没有特异性
  • 很多情况下D-Dimer都会升高,如恶性肿瘤、风湿性关节炎、重症监护病人、高龄、炎症以及妊娠等
  • 任何D-Dimer升高的情况必须作进一步的确诊调查

◆ D-Dimer阴性意味着血凝过程未被激活,所以 DVT或/和PE发生的可能性很低

◆ 排除性诊断:D-Dimer阴性结果的病人,不可能发生急性VTE

◆ D-Dimer对VTE筛查的有效性依赖于所用的检测方法

  • 排除DVT和PE需要使用敏感的和可靠的技术
  • 不用于特异性确诊
  • 同其他一些特定检查和病情结合评估
  • 检测方法必须经过临床验证

◆ D-Dimer的Cutoff值

  • Cutoff值的选择影响最终的实验性能
  • 正确选择Cutoff值能够得到对VTE理想的灵敏度,特异性和阴性预测值(NPV)
  • 市面上的各种D-Dimer试剂盒在抗体特异性、定标、报告单位、实验设置等方面都不尽相同,所以cutoff值可能是不同的

 

■ 弥漫性血管内凝血(DIC)诊断中的应用

DIC是不同病因导致局部损害而出现以广泛血管内凝血为特征的一种继发性综合征,它既可由微血管体系受损而致,又可导致微血管体系受损,严重损伤可导致多脏器功能衰竭。


DIC的外周血显微镜观察

◆ DIC的诊断标准
2017年最新中国DIC诊断标准

表1 中国弥散性血管内凝血诊断积分系统(CDSS)

 

表2 国际ISTH(国际血栓与止血标准化委员会)2001年诊断标准

项目 界值 分值

一、基础疾病

必需 不计分

二、实验室检查

 

① 血小板计数

>100G/L
>50, ≤100G/L
≤50G/L
0
1
2

② 纤溶标志物
(D-Dimer、FDP等)

不升高
中度升高
明显升高
0
2
3

③ PT延长

<3S
≥3S,<6S
≥6S
0
1
2

④ FIB水平

>1.0G/L
≤1.0G/L

0
1

中度升高:大于正常值,但不超过正常值5倍
明显升高:升高超过正常值5倍
如积分≥5为显性DIC,每日重复计分一次
如积分<5为疑诊DIC,每1~2日重复计分一次

◆ D-Dimer和DIC

  • D-Dimer是DIC诊断的一项敏感性指标,但不是特异性指标
  • D-Dimer阳性显示凝血酶和纤溶酶的活性
  • Cut-off值的制定
  • 阴性结果:提示病人不太可能发生DIC
  • DIC诊断实验组合

 

检测指标
串联试验(几个试验均为阳性)
敏感度(%) 特异度 (%) 诊断效率(%)
PT+PTT+TT 83 11 51
PT+PTT+Fg 22 100 65
PT+PTT+FDP 91 71 86
FDP+D-D 91 94 95

DIC实验诊断的评价

■ 血栓性疾病的诊断及溶栓疗效的观察

血管壁的损伤、血小板的激活、凝血功能的亢进及血流状态的变化,都会使循环血液中的有形成分在心脏或血管内形成异常凝块,堵塞部分或全部血管腔,导致血栓栓塞。D-二聚体含量升高的检出率为25%,在疾病的急性期升高幅度大,2周后有所下降,表明D-二聚体水平的波动与病程密切相关,能反映出纤溶酶的活性,可以作为观察溶栓疗效的一个特异性指标。

■ 血液病的临床意义

约有40%血液病患者血浆中D-二聚体含量明显升高。特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血友病、过敏性紫癜、急性再生障碍性贫血等出血性疾病患者血浆中的D-二聚体含量均显著升高,而且升高程度与出血严重程度成正相关。这表明血液病患者体内存在出血的同时,也存在着纤溶系统的激活。出血患者D-二聚体的升高是由于出血部位的血管内有血栓形成,继而激活纤溶系统,清除血管外血凝块的一种病理变化。

■ 妇产科正常孕妇及妊娠期高血压病患者血浆D-二聚体水平及其检测意义

正常孕妇处于相对高凝及继发性纤溶增强状态,而妊娠期高血压病患者更倾向于血栓形成和DIC的发生。因此孕妇及妊娠期高血压病患者血浆中D-二聚体的含量可能高于非妊娠期的正常人群,甚至超过cut-off值(0.5μg/ml)。据国外文献报导,有些正常孕晚期孕妇血浆中D-二聚体的含量可达到2.0μg/ml左右,因此产前检测D-二聚体的含量对妊娠期高血压病以及妊娠合并糖尿病等患者的病情监测和治疗有重要意义。

■ 恶性肿瘤患者血浆D一二聚体检测的意义

恶性肿瘤具有浸润和转移的特性,因此可能由于肿瘤细胞或坏死组织刺激释放促凝物质,激活外源性凝血系统造成凝血异常;同时纤溶酶原活化剂被激活升高,最终在局部生成纤溶酶,可直接降解细胞外间质,使肿瘤细胞具有侵袭性。国内外文献报导,有些恶性肿瘤患者中D-二聚体的含量要明显高于治疗有效的患者以及正常人,这提示恶性肿瘤激活凝血及纤溶的特性能够使稳定的交联纤维蛋白降解增强。对恶性肿瘤患者进行各种治疗,特别是放、化疗等对造血系统有损害的治疗时,应充分认识和注意恶性肿瘤所导致的这种高凝状态,早检查、早发现、早预防放疗和化疗等对造血系统损害所造成的凝血功能障碍。在治疗期间对D-二聚体进行动态监测,对肿瘤患者血栓的预防和治疗有重要的临床意义。而且血浆D-二聚体含量检测结果显示,含量增高者与肿瘤的转移密切相关,恶性肿瘤患者经治疗后,病情缓解,无转移者,血浆D-二聚体含量有不同程度下降,凝血和纤溶系统逐渐恢复正常,这也说明了对血浆D-二聚体含量的动态观察,有助于我们观察病情和疗效。国外有研究发现,结肠癌术前检测D-二聚体的水平被用于预测术后病人的生存期。还有研究发现在食道癌患者中治疗前血浆D-二聚体的水平可以作为化疗敏感性的预测指标。

■ 用于肝病病情的观察

肝病患者的血液呈高凝状态,血管内皮的损伤激活了内源性凝血途径。同时组织损伤或细胞破坏,使组织因子进入血循环,直接激活外源性凝血途径,最终激活纤溶系统。大多数肝炎患者血浆D-二聚体含量升高。急性肝炎轻度升高;慢性肝炎和肝硬化中度升高;重度肝炎高度上升。因此D-二聚体含量的升高幅度与病情严重程度有相关性。

■ 慢性支气管炎急性发作合并肺部感染

慢性支气管炎患者肺泡毛细血管基底膜增厚,内皮细胞损伤,血栓形成,管腔纤维化闭塞。肺部感染时引起肺泡毛细血管充血,内皮细胞损伤,激活了凝血及纤溶系统,使血液中D-二聚体浓度增加。通过监测血浆中D-二聚体浓度的动态变化,有助于判断炎症的病理及病情变化,对判断慢性支气管炎是否合并肺部感染有一定意义。

■ 其他应用

有研究发现,2型糖尿病患者血浆D-二聚体水平明显高于正常人,通过对糖尿病患者血浆D-二聚体的测定,可了解2型糖尿病患者血管的病变的情况。因此,D-二聚体可作为监测2型糖尿病病情发展的一项指标。

肾病综合征患者,特别是重症患者均有不同程度血液高凝状态,尤其当血浆白蛋白低于20g/L~25g/L时,即有静脉血栓形成的可能。D-二聚体水平可作为判断肾病综合征轻重的良好指标。

还有学者通过动态定量测定骨盆骨折病人血浆中D-二聚体含量的结果显示,骨盆骨折病人D-二聚体含量明显升高,并证实骨盆骨折病人存在高凝状态和纤溶亢进的病理生理变化。影响血浆D-二聚体浓度的因素有创伤、肺感染及癌症等。骨盆骨折本身的严重创伤是D-二聚体升高的重要因素。

 

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